Sede Amministrativa: Università degli Studi di Padova

Dipartimento di Farmacologia ed Anestesiologia di Padova

SCUOLA DI DOTTORATO DI RICERCA IN SCIENZE FARMACOLOGICHE

INDIRIZZO: Farmacologia, Tossicologia e Terapia

CICLO XXIII

 

 

Casarin, Elisabetta (2011) Studio dei meccanismi molecolari coinvolti nell'attività antiproliferativa dell'olio essenziale di Pistacia lentiscus. [Tesi di dottorato]

Abstract (inglese)

The phytocomplex from Pistacia lentiscus, a shrub of the Anacardiaceae family, is an essential oil obtained by hydrodistillation of leaves, fruits or from a trunk exudate (mastic gum). The mastic gum has been known to be effective in several gastric diseases, against Helicobacter Pylori and for its antibacterial and antifungine activities. Furthermore, Pistacia oil's major chemical constituents are monoterpenes with chemiopreventive and chemiotherapic properties.
We investigated the antiproliferative properties of the volatile oil from Pistacia lentiscus twigs and leaves using human cell lines from ovarian (2008 and cis-platinum resistant, C13*) and colon (LoVo) adenocarcinoma, and human stable fibroblast line (HFFF2) as in vitro models.
The MTT test showed that, after 3-hour treatment, phytocomplex (about 150 µg/ml) was able to inhibit the growth of all adenocarcinoma cell lines. After 24 hour treatment the IC50 on 2008 and LoVo cells resulted 3 times lower. On fibroblast line the phytocomplex was active only after 72 hour treatment. Western blotting analysis confirmed the oil capability to reduce carcinoma cell growth by decreasing the expression of p-ERK, MAPKs induced by mitogenic stimuli. In treated cells: vacuolisation, decreasing cellular size and brightness, directly proportional to reduction of cell viability, were observed by optical microscope.
Using annexin V with propidium iodide we observed that oil was able to stimulate apoptosis in a dose-dependent manner.
ROS has been recognized as an important mediator of the stress response; in particular, by regulating the loss of mitochondrial membrane potential. Furthermore upstream of ROS generation there is a respiratory chain block that leads even an increase of mitochondrial membrane potential.
Analysis of mitochondrial membrane potential, with Rhodamine123, and ROS generation, with H2DCF-DA, showed the oil capability to activate mitochondrial apoptotic pathway. Oil-treatment also induced alteration on H+ gradient and interruption of electron flow between respiratory chain complexes III and IV, thereby causing loss of ATP.
In the initiation of apoptosis caspases play critical roles. They can be grouped into "apoptotic initiators", for example caspase 8 and 9, and "apoptotic effectors", such as caspase 3, according to their substrate specificities and target proteins. Our data indicated that Pistacia lentiscus oil caused programmed cell death via a caspase-dependent pathway. In fact, after 3 hour treatment and 21 hour incubation, caspase 3 activity level, resulted higher than in the control, especially for the highest dose used.
We also performed a flow cytometry-based cell cycle analysis, observing that the phytocomplex induced dose-dependent arrest in G2/M phase by decreasing cyclin B1 levels on all adenocarcinoma lines, especially on ovarian cells, and acting on acetylated tubulin and microtubules' polymerization/depolymerization.

Abstract (italiano)

Il fitocomplesso ricavato da Pistacia lentiscus, una pianta arbustiva della famiglia delle Anacardiaceae, è un olio essenziale ottenuto per idrodistillazione da foglie, frutti o dall'essudato del tronco (mastice). Il mastice (il più noto dei fitocomplessi) è risultato essere efficace verso vari disturbi a livello gastrico e contro l'Helicobacter Pylori ed inoltre di avere attività  antibatterica ed antifungina. I principali costituenti degli oli ottenuti dal genere Pistacia sono i monoterpeni che presentano proprietà  preventive e chemioterapiche. Oggetto di studio di questi tre anni di dottorato è un olio essenziale di Pistacia lentiscus, ottenuto per idrodistillazione da foglie e ramoscelli, testato su una linea cellulare di adenocarcinoma del colon (cellule LoVo), una di adenocarcinoma dell'ovaio (cellule 2008) e la loro variante cis-platino resistente (cellule C13*) ed una linea di fibroblasti umani (cellule HFFF2).
Il test dell'MTT dimostra che dopo 3 ore di trattamento il fitocomplesso, alla dose di 150 µg/ml circa, è in grado di inibire la proliferazione di tutte le linee di adenocarcinoma. Dopo 24 ore di trattamento, invece, l'IC50 risulta 3 volte inferiore per le linee LoVo e 2008. Per contro, sulla linea non tumorale di fibroblasti umani il fitocomplesso si dimostra attivo solo dopo 72 ore di trattamento. L'analisi mediante Western blotting conferma la capacità  dell'olio di ridurre la crescita cellulare delle cellule di adenocarcinoma diminuendo in maniera dose-dipendente l'espressione delle p-ERK, MAP chinasi indotte da stimoli mitogeni. Mediante microscopia ottica, inoltre, si può apprezzare come le cellule trattate risultino più piccole, rotondeggianti e meno "luminose", ad indicare una loro minore vitalità .
Approfondendo i meccanismi d'azione dell'olio (mediante l'utilizzo di annexina V e ioduro di propidio) si osserva che il trattamento è in grado di attivare nelle cellule tumorali meccanismi di morte cellulare programmata.
E' noto che i ROS sono degli importanti mediatori della risposta agli stress cellulari, in particolare attraverso la mediazione della perdita del potenziale della membrana mitocondriale, e che, a monte della produzione di ROS, c'è un blocco della catena respiratoria che porta ad un concomitante aumento del potenziale della membrana mitocondriale. Le analisi di questo, mediante Rodamina 123, e della generazione di ROS, utilizzando H2DCF-DA, dimostrano la capacità  dell'olio di attivare la via apoptotica mitocondriale. Il trattamento è quindi anche in grado di indurre un'alterazione nel gradiente protonico ed un'interruzione del passaggio di elettroni attraverso la catena respiratoria causando così anche la diminuzione della produzione di ATP.
Nell'attivazione del processo apoptotico le caspasi giocano un ruolo cruciale. Questi enzimi, a seconda della specificità  di substrato e del target, possono essere raggruppati in "iniziatori" o "effettori" di apoptosi, tra questi ultimi la caspasi 3 risulta essere sicuramente la più importante.
I nostri risultati indicano che l'olio di Pistacia lentiscus è in grado di attivare la morte cellulare programmata attraverso la via caspasi-dipendente. Infatti, dopo 3 ore di trattamento e 21 di incubazione, i livelli della caspasi 3 si dimostrano più alti rispetto a quelli del controllo, specialmente per la dose maggiore adottata.
E' stata effettuata anche un'analisi citofluorimetrica del ciclo cellulare che ha permesso di osservare come il fitocomplesso induca un arresto del ciclo in fase G2/M in maniera dose-dipendente. Questo arresto avviene attraverso una diminuzione dei livelli citoplasmatici di ciclina B1, specialmente nelle linee di adenocarcinoma ovarico, e agendo sui livelli di tubulina acetilata e sui meccanismi di polimerizzazione/depolimerizzazione dei microtubuli.

Pistacia lentiscus

La specie P. lentiscus è una pianta sempreverde a portamento arbustivo alta fino a 3 metri, raramente arboreo alta fino a 8 metri, con accentuato odore di resina; la chioma è generalmente densa per la fitta ramificazione, di forma globosa e con rami a portamento tendenzialmente orizzontale; la corteccia è squamosa, di colore cenerino nei giovani rami e bruno-rossastro nel tronco; il legno è di colore roseo. Le foglie sono alterne, paripennate, glabre, di colore verde cupo; sono composte da 6-10 segmenti ottusi ellittico-lanceolati a margine intero e apice ottuso, lunghi fino a 30 mm, con piccolo mucrone apicale e rachide leggermente alato. I fiori sono dioici (maschili e femminili separati in piante differenti), attinomorfi, pentameri, tetraciclici, sono raggruppati in pannocchie cilindriche brevi e dense disposte all'ascella delle foglie dei rametti dell'anno precedente: i fiori maschili hanno 4 - 5 stami ed un pistillo rudimentale, sono vistosi per la presenza di stami di colore rosso vivo; i fiori femminili sono verdi con ovario supero e non presentano petali. I frutti sono drupe globose o lenticolari, di diametro 4 - 5 mm, carnose, rossastre, tendente al nero a maturità, che contengono un seme. La fioritura ha luogo in primavera, da aprile a maggio. I frutti rossi sono ben visibili in piena

estate e in autunno e maturano in inverno. Per quanto riguarda l’habitat, è una pianta eliofila, termofila e xerofila che vegeta dal livello del mare fino a 600 metri. È un tipico componente della macchia mediterranea sempreverde e spesso si ritrova in associazione con l'olivastro, la fillirea ed il mirto; è molto adattabile per il terreno, predilige però suoli silicei. Resiste bene a condizioni di prolungata aridità, mentre teme le gelate. Non è una specie colonizzatrice ma può assumere l’aspetto dominante nelle fasi di degradazione della macchia, in particolare dopo ripetuti incendi (Pignatti, 2003; Conti, 2005). La droga è data dalle concrezioni di resina essudata dalla pianta, chiamata gomma o mastice di lentisco, si presenta in grani globosi o piriformi, di colore giallo-pallido o verdognolo, di consistenza vetrosa, con superficie trasparente, liscia, lucente, spesso incrinata; ha odore debolmente balsamico, sapore acre amaro. Dal punto di vista chimico è composta per il 25% da acido masticonico, per il 20-30% da masticoresine, per il 4% da acido masticinico e per il 2% da pinene e da sostanze amare. Ha proprietà stomachiche, astringenti, espettoranti ed emostatiche. In Oriente è utilizzata come masticatorio per rafforzare le gengive e profumare l’alito (Masseri, 1981). Le proprietà terapeutiche dell’olio ottenuto dal mastice di P. lentiscus, proveniente dall’isola di Chio erano note già nell’antichità. In epoca più recente la letteratura riporta che: l’olio essenziale ricavato dalla resina ha elevata attività antibatterica, è fungicida e può anche proteggere lo stomaco da alcuni insulti cancerosi (Conner e Beuchat, 1984);

• l’estratto acquoso di P. lentiscus, ricco di potassio, calcio e magnesio, ha evidenziato nel ratto azione ipotensiva (Sanz, 1988);

• la corteccia e le foglie sono indicate contro la diarrea e la blenorragia;

• Il mastice, anche a basse dosi, agisce rapidamente contro l’ulcera peptica ed è efficace contro l’Helicobacter pylori (Huwez, 1998). Per quanto riguarda quest’ultimo punto, studi recenti hanno dimostrato che il mastice è in grado di indurre significative modificazioni morfologiche a carico del batterio. In particolare, le cellule di H. pilori mostrano, dopo trattamento, contorni irregolari e frequenti distacchi della parete dalla membrana citoplasmatica. 

Variabilità della composizione chimica dell’olio essenziale di Pistacia lentiscus

L’olio essenziale di Pistacia lentiscus si ottiene mediante idrodistillazione di foglie e frutti oppure dall’essudato del tronco (mastice). Numerosi sono gli studi riguardanti la composizione chimica dell’olio ottenuto dalle foglie di P. lentiscus. Il primo, del 1966, riporta l’analisi di un olio proveniente dalla Francia che risulta particolarmente ricco di monoterpeni. Dall’analisi degli studi riportati in letteratura è possibile concludere che, a seconda dell’area geografica di provenienza, i vari oli sono caratterizzati da un diverso monoterpene, in particolare il myrcene è presente per 19 - 25% nell’olio proveniente dalla Spagna e dalla Sicilia (Calabro e Curro, 1974; Boelens e Jemenez, 1991); l’a-pinene è presente per il 16% in quello francese (Buil, 1975); il terpen-4-ol è presente per 22% in quello proveniente dalla Sardegna (Castola, 2000) ed il d-3-carene caratterizza (65%) l’olio egiziano (De Pooter, 1991). Componenti presenti in minor quantità sono alcuni sesquiterpeni, quali: D-germacrene (9%) (Boelens e Jemenez, 1991), il b-caryophyllene (3.5 - 9%) (Buil, 1975; Boelens e Jemenez, 1991), d-cadinene e a-cadinolo (6% di ognuno) (Buil, 1975), b-bisabolene, b-bourbonene e caryophyllene oxide (circa 3 - 4% di ognuno) (De Pooter, 1991). Le concentrazioni dei vari monoterpeni cambiano significativamente se l’olio è ottenuto dal frutto. In particolare, confrontando due oli uno proveniente dalla Spagna (Boelens e Jemenez, 1991) ed uno dall’Australia (Wyllie, 1990) si ottengono, quali maggiori componenti, myrcene

(rispettivamente 72 e 39%), a-pinene (10 e 28%) ed il limonene (7 e 11%). Gli oli ottenuti per idrodistillazione dal mastice proveniente dalla Spagna e dalla Grecia sono invece caratterizzati da un elevato contenuto di a-pinene (65 - 86%) e da un basso contenuto di myrcene (3 - 25%) (Scurbis e Markakis, 1975; Papageorgiou, 1981; Katsiotis e Oikonomou, 1984; Boelens e Jemenez, 1991).Magiatis e coll. (1999), mediante gas-cromatografia e spettroscopia di massa, hanno identificato 69 componenti di tre oli essenziali di P. lentiscus, var. chia, ottenuti rispettivamente dalle foglie, dai ramoscelli e dal mastice. In tabella 2 sono riportati i componenti presenti in maggiore quantità.